MICROBIOLOGIA

MICROORGANISMOS

A microbiologia tem um papel essencial no monitoramento da qualidade de alimentos, água e do ambiente.
A Biocen do Brasil oferece meios de cultura destinados a detecção de microrganismos: isolamento e identificação.
As enterobacteriaceas são bacilos gram negativos com muitas propriedades em comum. Habitam o intestino humano e de animais de sangue quente.
Os principais gêneros da família Enterobacteriaceae são: Escherichia, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Proteus, Yersinia entre outros.

Testes bioquimicos. Escherichia Shigella Salmonella Citrobacter Klebsiella Enterobacter Hafnia Proteus Yersinia
Lactose + - - D + + - - -
Gás (glicose) + - + + + + + + -
H2S - - + D - - - D -
Uréase - - - D + D - + +
L-TD - - - - - - - + -
Motilidade D - + + - + + + D
Indol + D - D - - - D D
Lisina + - + - + D + - -
Citrato de simmons - - + + + + - D D


As enterobactérias são bacilos gram negativos pertencentes a família das Enterobacteriaceae. Estão amplamente distribuídos no solo, água plantas e no intestino do homem e animais. Podem causar infecções intestinais e extra intestinais. O choque endotóxico é uma manifestação letal da infecção por bactérias gram negativas. As endotoxinas são lipopolisacárides farmacologicamente ativos, contidos no interior das paredes celulares das gram negativas. Esses lipopolissacarideos são estruturados por três regiões:
(1) uma porção variável externa de carboidratos que determina a especificidade antigênica (ex: vários sorotipos de Salmonella); (2) um cerne ou centro de polissacarídeo que é estruturalmente similar entre as espécies e (3) uma porção lipídica altamente conservada, denominada lipídio A. As bactérias entéricas gram negativas possuem, comumente, um único e grande plasmídio R que codifica para a resistência a vários antibióticos. Cepas dos gêneros Enterobacter, Serratia, Klebsiella e Providencia, além de várias cepas indol positivas de Proteus e cepas cefalotina resistentes de E. coli, possue ?-lactamases induzíveis que proporcionam resistência cruzada a vários antibióticos do grupo dos ?-lactâmicos.
A característica morfológica da colônia de um microrganismo em meio de agar pode ser uma forma de identificação pois as enterobacteriáceas produzem colônias secas ou mucóides relativamente grandes de coloração cinza opaca em agar sangue. A hemólise em agar sangue é variável e não distinta. As colônias que aparecem como ondas (dispersão) sugerem motilidade, provavelmente Proteus. As colônias vermelhas em agar MacConkey ou com brilho verde em agar eosina azul de metileno (BEM) indicam que o microrganismo é capaz de formar ácido a partir da lactose do meio.
Entretanto, a diferenciação das enterobactérias se baseia na presença ou não de enzimas codificadas por genes cromossômicos. Essas enzimas participam do metabolismo bacteriano e podem reagir com substratos incorporados aos meios de cultura. Junto com um indicador, pode identificar a utilização do substrato ou de produtos metabólicos específicos estabelecendo um perfil bioquímico que identifica a espécie.
É possível evitar perda de tempo e identificações errôneas realizando-se observações preliminares. Com poucas exceções, as enterobactérias têm as seguintes características:
- fermentação da glicose,
- oxidase negativa,
- redução de nitrato a nitrito,
Por definição, fermentação é um processo metabólico de óxido-redução que ocorre em meio anaeróbio. Nas provas bioquímicas, esse processo é detectado pela observação da mudança de cor por indicadores de pH como conseqüência da formação de produtos ácidos. A acidificação do meio de prova pode ocorrer através da degradação de carboidratos por vias diferentes que não a fermentação, ou pode haver em alguns meios componentes diferentes de carboidratos que resultem em produtos finais ácidos. Embora a maioria das bactérias que metaboliza carboidratos seja anaeróbia facultativa, a utilização pode nem sempre ocorrer em condições estritamente anaeróbias. Todas as enterobactérias fermentam a glicose formando ácido pirúvico (via de Embden-Meyerhof). As bactérias são diferenciadas pelo carboidrato que metabolizam e pelos tipos e quantidade de ácidos produzidos. Na fermentação da glicose pela Escherichia coli ocorre uma fermentação ácida mista o que resulta na produção de grandes quantidades de ácidos acético, lático e fórmico ocasionando uma acentuada diminuição do pH no meio de prova. Isto pode ser observado no teste positivo do vermelho de metila. Por outro lado, o grupo Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia metabolizam o ácido pirúvico pela via do butileno gllicol produzindo acetil metil carbinol (aceína), observado na prova positiva de voges-Proskauer (VP). Observe que os principais produtos dessa via são álcoois com produção de pequena quantidade de ácido gerando uma prova de vermelho de metila negativa para esse grupo de microrganismos.
O gás resultante da fermentação bacteriana é formado da clivagem do ácido fórmico. A produção de gás é melhor observada em meio líquido para fermentação de carboidratos com a colocação de tubos de Durham invertidos . Bactérias que não formam ácido fórmico são incapazes de formar gás (a maioria das Shigella), contrariamente aos microrganismos que utilizam a via butileno glicol que produzem grandes quantidades de CO2 como o grupo Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia.
A fermentação da lactose é mais complexa que a da glicose. A lactose é um dissacarídeo composto por glicose e galactose (ligação galactosídica). Ao ser hidrolisada, ocorre a liberação da glicose e da galactose. Para metabolizar a galactose, duas enzimas devem estar presentes: (1) ?-galactosídeo permease e (2) ?-galactosídase enzima necessária para hidrolisar a ligação ?-galactosídica após a lactose ter entrado na célula. Como a fermentação da lactose ocorre por degradação da glicose, microrganismos que não podem fermentar a glicose não podem formar ácido a partir da lactose. Isto explica porque a glicose não faz parte dos meios de isolamento primário como o agar MacConkey e BEM pois impediria a visualização de fermentação da lactose.
O ONPG (?-nitrofenil-?-D-galactopiranosídeo permanente) é um composto similar à lactose. O que difere é a substituição da glicose pelo grupo (?-nitrofenil). A prova de ONPG consiste na detecção da enzima ?-galactosídase, sendo útil para identificar fermentadores tardios de lactose.
O teste de oxidase pode ser observada utilizando-se fitas de oxidase. A presença de pigmentação púrpura significa que a bactéria possue a enzima citrocromo axidase (oxidase +). Bactérias que não possuem a enzima são oxidase –, não apresentando pigmentação nas fitas de oxidase.

Outras provas bioquímicas utilizadas para a identificação de enterobactérias são: o vermelho de metila, Voges-Proskauer, citrato de Simmons, teste da urease, meio de Kliger, indol e a pesquisa da triptofano desaminase.
No teste de vermelho de metila observa-se se o microrganismo é capaz de produzir ácidos em quantidade suficiente para abaixar o pH em valores inferiores a 4,4. Isto indica que o microrganismo em questão realiza uma fermentação ácida mista (ácido fórmico, acético, lático e succínico) – VM+. Caso não ocorra a virada do meio para o vermelho, o teste é negativo e a cor do meio se mantém. No teste de Voges-Proskauer pesquisa-se bactérias fermentadoras de glicose através da fermentação butanodiólica. VP+ o meio tem coloração vermelha, VP- meio amarelo claro.

Salmonella - bacilo gram negativo pertencente a família Enterobacteriaceae, com ou sem presença de flagelos e intracelulares facultativas. A patogenicidade das salmonelas varia de acordo com o tipo sorológico, idade e condições de saúde do hospedeiro. A S. typhi é o agente da febre tifóide. As salmonelas paratíficas causam infecção semelhantes a febre tifóide. Os demais sorotipos de Salmonella causam uma enterocolite sem complicações que desaparece em uma semana. As salmonelas são geralmente veiculadas por alimentos contaminados e a infecção é denominada de intoxicação alimentar. Em crianças, a salmonela frequentemente invade a circulação afetando vários órgãos. A infecção por Salmonella tem início na mucosa intestinal e quando há enterocolite sem invasão da corrente sangüínea, a salmonela atravessa a camada do epitélio e se prolifera na lâmina própria da mucosa. Quando há infecção sistêmica, a Salmonella cai na corrente sangüínea via linfática.
O diagnóstico das infecções por Salmonella é realizado um enriquecimento e o isolamento em agar verde brilhante, agar SS e agar MacConkey. A identificação é feita por provas bioquímicas e por sorologia.

Shigella - o gênero Shigella é constituído de 4 es[écies: S. dysenteriae, S. flexneri, S.boydii, S. sonnei. Os sorotipos de Shigella são caracterizados somente pelos antígenos O ou somáticos uma vez que essa bactéria é desprovida de antígenos capsulares (K) e flagelares (H). A doença causada pela Shigella é denominada de shigelose ou disenteria bacilar. Ocorre uma invasão e destruição da camada epitelial da mucosa com intensa reação inflamatória acarretando leucócitos, muco e sangue nas fezes. Na infecção por Shigella dysenteriae tipo I (bacilo de shiga) pode aparecer a síndrome hemolítica urêmica gerada pela presença de altos níveis de verotoxina I (VT I). A infecção pode ser adquirida pela ingestão de água e/ou alimentos contaminados, além do contato pessoal. O diagnóstico é feito pelo isolamento da Shigella, a partir de fezes, em meio MacConkey e SS. A identificação é feita por testes bioquímicos e sorológicos.

Yersinia - o gênero Yersinia compreende a Y. pestis, Y.enterocolitica, Ypseudotuberculosis, Y.frederiksenii, Y.kristensenii e Y. intermedia sendo que as 3 últimas não são associadas a doenças humanas.
Y. pestis é o agente etiológico da peste e tem os roedores como reservatórios e as pulgas como veículos. O homem pode adquirir a doença após ser picado pela pulga ou por manipulação de animais contaminados. A peste se caracteriza de 3 formas clínicas: bubônica, pulmonar e septicêmica. A bubônica caracteriza-se pela inflamação dos linfonodos principalmente os axilares e inguinais. A fase pulmonar pode ocorrer como uma complicação da bubônica ou ser adquirida por contato com pacientes com infecção pulmonar. A septicêmica é rara mas pode ocorrer no pico da epidemia. O fator de virulência de Y. pestis são os antígenos superficiais que a tornam resistentes à fagocitose. Essa bactéria produz, também, uma exotoxina.
Y. enterocolitica é uma espécie bastante heterogenia. São encontradas no ambiente e em animais normais ou acometidos pela doença e causam diferentes tipos de sintomatologia, sendo a principal a infecção intestinal manifestada por diarréia e dores abdominais. Infecções sistêmicas podem ocorrer e geram doenças debilitantes como cirrose hepática, eritrema nodoso, artrite, conjuntivite e osteomielites. A infecção intestinal é adquirida pela ingestão de alimentos contaminados. O isolamento é realizado em agar MacConkey e SS com posterior identificação bioquímica e sorológica da bactéria.

E. coli – bacilo gram negativo pertencente as enterobactérias. O gênero Escherichia compreende as espécies E. coli, E. hermanii, E. fergusonii, E.vulneris e E. blattae. Seis são as categorias de E. coli enteropatogênicas: E. coli enteropatogênica clássica (EPEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC) E. coli enteroaderente (EAEC) e E. coli enteroagregativa (EAggEC).
As EPECs são os agentes mais freqüentes de diarréia infantil. Os sorotipos mais comuns são O111:H-, )111:H2 e O119:H6. A capacidade da bactéria em aderir à mucosa intestinal é mediada por plasmídio. A adesão pode ser difusa, quando ocorre em toda a superfície da célula, ou localizada quando a adesão se dá em certos locais da célula. Após se aderirem a célula, inicia-se a produção de citotoxinas semelhantes a toxina de Shiga (Shigalike). O reservatório é o homem e o isolamento de EPEC das fezes é realizado em ágar MacConkey. A identificação ocorre por provas bioquímicas e pelo emprego de soros polivalentes que são empregados para a identificação presuntiva e os soros monovalentes que são usados para a confirmação.

As EIECs são imóveis pois não dispõem de flagelos, não descarboxilam a lisina e apresentam um plasmídio que transporta determinantes genéticos responsáveis pela penetração nas células epiteliais. As EIECs proliferam no interior das células causando uma infecção e necrose da mucosa do íleo e cólon.
As infecções intestinais causadas por EIEC são comuns em crianças com mais de 2 anos e são adquiridas por ingestão de alimentos e água contaminados ou por contato pessoal. A detecção é realizada por cultivo de fezes em agar MacConkey e agar SS e por provas bioquímicas e sorológicas.

As ETECs são os biosorotipos de E. coli que produzem enterotoxinas termolábeis e termoestáveis. As toxinas termolábeis são conhecidas por LT I e LT II e as toxinas termoestáveis por STa e STb. As EIECs isoladas de seres humanos raramente produzem enterotoxinas LT II e nunca a enterotoxina STb.
A enterotoxina LT I é uma proteína imunogênica com peso molecular de 100.000 daltons cuja molécula possui 5 subunidades periféricas (subunidade B) e uma central (subunidade A). As subunidades B fixam a toxina à superfície da célula epitelial e a subunidade A altera o metabolismo celular, pois bloqueia a absorção de sódio estimulando a excreção de potássio e carbonato pelas células das criptas. Isto determinará um aumento do volume de líquido na luz intestinal e consequentemente a diarréia. A enterotoxina LT I é semelhante a enterotoxina produzida pelo Vibrio cholera. A STa contariamente a LT I é uma molécula pequena (17-18aminoácidos) e não imunogênica pesando aproximadamente 5.000 daltons. A STa é uma potente toxina que também altera o metabolismo hidrossalino da mucosa intestinal. Além das enterotoxinas, ETEC apresentam fímbrias usadas para fixá-las à mucosa do intestino delgado. Essas fímbrias são imunogênicas e são conhecidas como fatores de colonização. São pelo menos 3 fatores de colonização imunologicamente distintos de origem humana. Depois que a bactéria atravessa a barreira gástrica, ela se fixa na mucosa intestinal por meio do fator de colonização (as fimbrías).uma vez fixada, começa a se proliferar e produzir as enterotoxinas que determinarão a diarréia aquosa. As enterotoxinas LT I e STa assim como os fatores de colonização, são codificados por genes localizados em plasmídios designados de ent. As ETECs acorrem em crianças e em adultos e é conhecida como a diarréia do viajante. Seu reservatório é o próprio homem e a infecção se transmite pela ingestão de água e alimentos contaminados. A infecção por ETEC é superficial, não havendo penetração do epitélio intestinal. Desta forma, os pacientes não apresentam leucócitos, sangue ou muco nas fezes. O isolamento de ETEC se faz em agar MacConkey e na pesquisa de enterotoxinas LT I e STa. A enterotoxina LT I pode ser demonstrada em cultura de células e por testes de aglutinação de hamácias sensibilizadas pela toxina. A pesquisa de STa geralmente é feita por inoculação em camundongos recém nascidos.

A EHEC determina uma diarréia sanguinolenta que é denominada de collite hemorrágica. Está associada a ingestão de alimentos contaminados e é conhecida como a doença do hambúrguer. As EHEC produzem duas citotoxinas semelhantes a toxina de Shiga (Shigalike toxin) SLT I e SLT II ou verotoxinas (VT) I e II . Essas toxinas são codificadas por bacteriófagos lisogênicos e são as responsáveis pela hemorragia intestinal e pela síndrome hemolítica urêmica que pode acompanhar a colite hemorrágica. As EHEC aderem à mucosa intestinal por fímbrias codificadas por plasmídios. A identificação se dá pela dosagem de toxinas em cultura de células Vero ou por sondas genéticas que detectam os genes que as codificam.
O sorotipo que representa esse biogrupo é a E. coli O157:H7.

Listeria monocytogenes – O gênero Listeria compreende a L. monocytogenes que é patogênica para o homem, e outras espécies não patogênicas geralmente encontradas no solo, vegetais, animais e no homem. A L. monocytogenes causa beta hemólise. A listereriose pode ser confundida com outras doenças, pois sua sintomatologia pode se assemelhar a um resfriado comum, a uma inflamação de garganta, uma septicemia severa ou a doenças do sistema nervoso central. Infecções inaparentes podem ser transmitidas durante a gestação via placenta, o que resulta em aborto. A infecção pode também ser transmitida durante o parto em decorrência de aspiração do líquido aminiótico. A listeriose é uma causa freqüente de abortos e mortalidade de recém nascidos. No adulto, a principal doença é a meningite, e no idoso a mortalidade é bastante alta (70%). São bacilos gram positivos flagelado, resistente a temperaturas de refrigeração.

Pseudomonas - bacilo gram negativo que são diferenciados entre eles por testes bioquímicos, de sensibilidade a antibióticos, formação de pigmentação, número e localização dos flagelos. As espécies comumente isoladas correspondem a P. aeruginosa, P. malthophila e P.cepacia.
P. aeruginosa tem a capacidade de produzir um pigmento esverdeado denominado piocianina. É um germe oportunista que infecta processos cirúrgicos e queimaduras podendo resultar em bacteremias severas, ceratites em cirurgias oculares e pneumonias. O cultivo é realizado a partir de material infectado e identificado por série bioquímicas e pela presença de pigmentos.

Staphylococcus – O gênero compreende várias espécies, sendo duas delas as mais importantes: S. aureus, S. epidermides. São cocos gram positivos, com divisão em vários planos tendendo a formar cachos de uvas. A diferenciação entre as espécies se dá pelo testes de coagulase (S. aureus coagulase + e S. epidermides coagulase -).

Streptococcus – Os estreptococos são denominados de várias maneiras. A designação mais comum tem por base a hemólise em ágar sangue. Se a hemólise é total disse que o estreptococos é beta-hemolítico, se for parcial que ele é alfa hemolítico e, não havendo hemólise disse que ele é gama hemolítico ou não hemolítico. Os estreptococos alfa hemolíticos que costumam conferir coloração esverdeada às hemácias por transformação da hemoglobina em uma substância semelhante a bilerrubina são conhecidos por S. viridans.
São cocos gram positivos que se dividem em um só plano e se agrupam em cadeias de tamanho variável. Fazem parte desse grupo o S. pyogenes, S. agalactiae, S. faecalis, S. bovis, S. pneuminiae.

Neisseria – O gênero Neisseria compreende várias espécies que podem ser diferenciadas por meio de provas bioquímicas. A N. gonorrhoeae ou gonococo e a N. meningitidis ou meningococo causam gonorréia e meningite, respectivamente. Essas são resistentes à vancomicina e a polimixina. As neisserias são cocos gram negativos que se agrupam em pares geralmente. Os bordos dos pares são achatados ou levemente côncavos semelhantes ao grão de feijão.

Haemophylus – O gênero Haemophylus é um bastonete gram negativo cultivável em meios que contenham sangue. As espécies mais patogênicas para o homem são H. influenzae, H. parainfluenzae, H. haemolyticus e H. aphrophilus que são encontrados nas vias aéreas superiores. H. ducreyi é o agente do cancro mole, uma doença venérea. São cocobacilos bem pequenos, gram negativo.

Brucella – O gênero Brucella é constituído por cocobacilos ou bacilos gram negativos. São 3 as espécies de importância para o homem: B. abortus, B. melitensis e B. suis. A doença é a brucelose que é bastante invasiva, podendo penetrar no organismos através da mucosa digestiva e ocular. A brucela é um parasita intracelular do sistema retículo-endotelial. A brucelose é uma zoonose, pois o homem a adquire através do contato com animais doentes.

Bibliografia Consultada

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Silva,N, Junqueira,V.C.A., Silveira,N.F.A. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. 1997.
Trabulsi, L.R. Microbiologia. 2ª. Ed.1991

 

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